Микробиологическая диагностика эшерихиозов

Цель. Изучить классификацию и особенности патогенеза эшерихиозов. Овладеть методами оценки результатов лабораторного исследования для подтверждения диагнозов эшерихиозов. Научиться практически решать вопросы по использованию эубиотиков для коррекции микрофлоры кишечника.

Выбор исследуемого материала — испражнений – определен локализацией патологического процесса в кишечнике. Посев производят на среду Левина или на среду ЭНДО – темно-красные колонии с металлическим блеском. Для выявления патогенных вариантов кишечных палочек учитывают антигенное строение этих микроорганизмов: О-, К- и Н-антигены. Агглютинация с ОК-сывороткой материала из колонии позволяет определить наличие О-антигена, свидетельствующего о патогенном варианте этих бактерий. В то же время антиген К(В) обусловливает О-инаглютинабельность микроорганизмов, а о серогруппе эшерихий судят по О-антигенам. Разрушение термолабильных К- и Н-антигенов позволяет определить принадлежность выделенных бактерий к той или иной серогруппе.

Для чего необходимо бактериологическое исследование?

Бактериологические исследования позволяют идентифицировать возбудителя болезни и установить его степень чувствительности к определенным антибиотикам для выявления эффективности лечения. Данный метод исследования широко применяется в медицинской практике инфекционистами, отоларингологами, гинекологами, урологами, онкологами, хирургами и другими специалистами. Он назначается при любых воспалительных заболеваниях в организме и при подозрении на развитие сепсиса.

Как правильно осуществить забор материала?

Материалом для бактериологических исследований может служить кровь, ликвор, мокрота, испражнения, моча, желчь, спинномозговая жидкость, грудное молоко, выделения из ротовой полости, половых органов, зева, носоглотки и ран.

Как проходит исследование?

Плюсы и минусы бактериологического исследования

Бактериологический посев имеет несколько преимуществ:

• характеризуется высокой специфичностью;
• позволяет проводить исследование любой биологической жидкости;
• дает возможность определить чувствительность патогенного микроорганизма к определенному лекарству и правильно подобрать терапию.

Но есть у этого метода и некоторые недостатки:

• результат можно получить только по происшествии нескольких дней;
• требует высокой квалификации персонала бактериологической лаборатории;
• предъявляет высокие требования к забору материала.  

Результат исследования

Результатом бактериологического исследования является обнаружение возбудителя (или его отсутствие) в собранном материале и выявление его концентрации, что позволяет подобрать результативную терапию и эффективно избавиться от возбудителей.

Расшифровка бакпосева

Результат анализа оценивается по нескольким показателям, учитывающим не только качественный фактор (подтверждение наличия бактерий-возбудителей в среде), но и количественный — то есть, степень концентрации патогенных микроорганизмов в исследуемом материале. Для подсчета количества микробных клеток используется понятие колониеобразующей единицы (КОЕ), по которому можно определить уровень насыщенности бактериями изучаемого образца.

Выделяют 4 степени роста возбудителей:

• Первая — скудный рост бактерий на жидкой питательной среде и отсутствие роста на твердой среде. Такой результат не считается отклонением от нормы.
• Вторая — рост бактерий на твердой среде до 10 колоний. Свидетельствует не о наличии болезни, а скорее о загрязненности лабораторных принадлежностей для исследования.
• Третья — рост бактерий на твердой среде в пределах 10-100 колоний.
• Четвертая — более 100 колоний.

В заключении, выдаваемом на руки пациенту, результаты бакпосева обозначаются следующим образом:

• указывается название выявленного возбудителя на латинском языке (например, Trichomonas vaginalis — трихомонада);
• прописывается концентрация микроорганизма, выращенного в условиях питательной среды (норма — до 103 КОЕ/мл, ненорма — от 105 КОЕ/мл);
• указывается характер среды: флора условно-патогенна, патогенная.

Одновременно с определением концентрации бактерий производится анализ их чувствительности к антибиотикам. Наличие положительной реакции на тот или иной антибактериальный препарат обозначается символом «S», отрицательной — «R».

Применяемое оборудование

При исследовании используется такое оборудования:

• банки с широким горлышком;
• стеклянные воронки;
• конусовидные колбы;
• колбы вместе с тубусом;
• стеклянные флаконы;
• лабораторная посуда;
• пипетки;
• цилиндры;
• бактериологические пробирки;
• спиртовки;
• лабораторные стаканы;
• покровные и предметные стекла;
• бактериологические чаши;
• пробирные поплавки;
• электрический автоклав;
• фильтровальные аппараты;
• кристаллизаторы;
• вакуумный насос;
• лабораторные весы.

Для анализа также используется водоструйный насос. Применяется его лабораторный вариант, выполненный из стекла. Используется водяная баня. Обязательным элементом является биологический микроскоп.

Применяются также:

1. осветители;
2. металлические пеналы;
3. сигнальные часы;
4. сетчатые пластины;
5. увеличительные лупы;
6. pH-метры (для измерения кислотности);
7. дистилляторы.

Дополнительно используются:

• электрические термостаты, они предназначены для выращивания микроорганизмов при определенной температуре.
• счетный прибор для измерения выращенных колоний бактерий и сушильные шкафы.

Обязательным элементом являются холодильники. Используются как электрические, так и газовые с температурным режимом от 4С до 6С. Могут применяться походные сумки-холодильники, если бактериологический анализ проводится в полевых условиях.

Бактериоскопический метод исследования

Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.

Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания включают последовательное использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

1)Бактериоскопический метод исследования в гинекологии:

Основные задачи анализа

Здесь перечислены по пунктам цели и этапы бактериологического метода исследования.

1. Получить исходный материал, который будет использоваться для выделения колоний бактерий. Это может быть мазок с поверхности любого предмета, слизистой оболочки или полости органа человека, анализ крови.

2. Выращивание культуры на твердой питательной среде. Через 24-48 часов на чашке Петри можно обнаружить колонии бактерий разных видов. Отбираем по морфологическим и/или биохимическим критериям нужную и проводим уже с ней дальнейшую работу.

3. Размножение полученной культуры. Бактериологический метод исследования может опираться на механический или биологический способ увеличения численности культуры бактерии. В первом случае ведется работа с твердыми или жидкими питательными средами, на которых в термостате размножаются бактерии и образуют новые колонии. Биологический способ требует естественных условий увеличения численности бактерий, поэтому здесь микроорганизмами заражается подопытное животное. Через несколько суток в пробе крови или мазке можно обнаружить множество прокариот.

4. Работа с очищенной культурой. Чтобы определить систематическое положение бактерий, а также их принадлежность к возбудителям заболеваний, необходимо провести тщательный анализ клеток по морфологическим и биохимическим признакам

При исследовании патогенных групп микроорганизмов важно знать, насколько эффективно действие антибиотиков

Это была общая характеристика бактериологического метода исследования.

Микроскопия

Наиболее простым методом бактериологического исследования называют микроскопию. Она представляет собой рассмотрение какого-либо биологического объекта под микроскопом. Таким образом, можно рассмотреть грибы, простейшие организмы. Микроскопия является наиболее старинным методом бактериологических исследований. Он не обладает высокой точностью, но результат получается достаточно быстро.

Примером эффективности микроскопии можно назвать диагностику дифтерии. При любом подозрении на данное заболевание делается мазок из зева. Так как дифтерийные палочки имеют специфический внешний вид, то обнаружить их довольно легко.

Дополнительное диагностическое значение микроскопии заключается также и в том, что при ее проведении видны микробы и лейкоциты. Форма обнаруженных клеток помогает выявить специфику воспаления. Если много нейтрофилов, то воспаление называют бактериальным, если воспаление аллергическое, то наблюдается увеличение эозинофилов.

Определение 4

Нейтрофилы – это тип лейкоциты, которые жизненно важны для работы иммунной системы против патогенов. Они помогают бороться с инфекциями и предотвращают длительное повышение воспаления.

Определение 5

Эозинофилы – это разновидность лейкоцитов, основная функция которых заключается в борьбе с многоклеточными паразитами.

Далее эволюция методов бактериологических исследований шла по пути развития культурального метода. В большинстве случаев, чтобы понять, о какой бактерии пойдет речь исследуемый объект помещают в питательную среду, где создаются условия для интенсивного бактериального роста.

В результате на питательной среде вырастают колонии микроорганизмов, свойства этих колоний исследуют конкретные штаммы бактерий.

Забор и транспортировка

Для проведения исследования требуется правильно подготовить воду. Ее забор делается по схеме:

1. Берется только стерильная бутылка.
2. Водопроводный кран, откуда будет делаться забор воды, предварительно обжигается.
3. Из крана на протяжении 7-10 минут должна сливаться вода. Только после этого ее можно набирать в стерильную емкость.
4. Тара наполовину набирается водой, закрывается пробкой и перевозится в лабораторию. При этом вода при доставке к месту анализа не должна контактировать со стерильной пробкой.

Для исследования подходит только та вода, с момента забора которой прошло не больше 1,5 часа.

Сам анализ проводится по следующему плану:

1. Осуществляют подготовку лабораторной посуды и всех материалов. Вся посуда стерилизуется, промывается и тщательно сушится. Стерилизация происходит в сушильном шкафу. Температура внутри него должна быть порядка 160-165С. Посуда обрабатывается сухим жаром на протяжении часа. Вместо сушильного шкафа может применяться автоклав. В нем температура ниже – порядка 126С. Обработка длится полчаса.
2. Простерилизованную посуду вынимают из шкафа только после того, когда он остынет до температурных значений меньше 60С.
3. Обработанную посуду помещают в лабораторные шкафы. Они должны плотно закрываться.
4. Готовят стерильную воду. Сначала исследуемая вода разливается по флаконам, которые закрываются пробками. После этого флаконы с водой стерилизуются в автоклаве в течение 20 минут при температуре 120С. Такая вода пригодна для использования в течение 2 недель.
5. Готовят питательную среду. Ее компонентами может быть как мясной бульон, так и глюкоза, лактоза или фильтрованная желчь скота.
6. Готовят химические реактивы для конкретного анализа.
7. Подготовленную питательную среду ставят на водяную баню, после чего охлаждают до 45-50С.
8. Расставляют стерильные чаши с пометками.
9. Берут несколько проб питательной среды и делают два посева в стерильные чаши.
10. Колбы со взятой для анализа воды открывают, обжигают их горлышки и немного продувают их воздухом через пипетку. Она должна быть стерильной.
11. Чистой палочкой делается забор воды. Она добавляется в стерильные чаши, которые закрываются пробкой.
12. Взятая вода заливается остуженным питательным раствором. Чаша со смесью быстро перемешивается вращательными движениями. Далее чаша ставится на ровную поверхность. Смесь внутри нее должна застыть.
13. Чаша с застывшим раствором переворачивается вверх дном и ставится в термостат. Там создается оптимальная среда для выращивания посевов (37С). Чаша находится в термостате сутки.
14. Чаша с выращенными колониями микроорганизмов кладется на затемненный фон вверх дном. При помощи лупы делается подсчет количества появившихся колоний бактерий. При подсчетах учитывается число микроорганизмов на 1 см3 взятой для анализа воды.
15. Результаты фиксируются в протоколе и регистрационном журнале. Дополнительно фиксируются особые условия, при которых проходил анализ.

Санитарная микробиология. Предмет изучения, цели и задачи.

Задачи:

3.1. Исследования бактериальной обсемененности воздушной среды

количество колоний S. aureus в 1 м3 воздуха (КОЕ/м3);

Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 дм3 для определения общего количества микроорганизмов, дрожжевых и плесневых грибов и 250 дм3 для определения S. aureus. Исследование воздуха седиментационным методом не допускается.

Примечание: При переносе аппаратов и устройств для отбора проб воздуха из одного помещения в другое их поверхность обрабатывают раствором дезинфицирующего средства. Столик, внутренние стыки, крышку и прочие части прибора с внутренней и внешней стороны протирают спиртом (70 %).

1. Первый день.

2. Второй-третий день.

3. Четвертый день.

Если культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется учитывать другие признаки, позволяющие определить принадлежность штамма к виду S. aureus (ферментация маннита, гемолитическая активность).

4. Пятый день.

Современные методы бактериологического исследования

Все бактериологические исследования можно разделить на две группы в зависимости от того, каков предполагаемый результат.

I. Исследуемый объект должен быть стерилен.

В такой ситуации обнаружение любого микроорганизма является поводом для серьезного беспокойства. О чем идет речь? О крови, моче, материнском молоке, спинномозговой жидкости. Принципиально другой вопрос состоит в том, что взять для бактериологического исследования мочу или молоко и не нарушить при этом стерильности — очень сложно и практически невозможно в амбулаторных условиях. Неудивительно, что к положительным результатам, когда в моче или молоке обнаруживается некая бактерия, врачи часто относятся с определенной (весьма значительной) долей скепсиса. Никогда не бывает стопроцентной уверенности в том, что этот микроб действительно живет в молоке, а не попал туда с поверхности кожи, действительно живет в моче, а не на слизистой оболочке мочеиспускательного канала.

II. Для исследования берется заведомо нестерильный материал.

Всегда, когда изучается нечто, находящееся в контакте с окружающей средой, это нечто содержит бактерии. Любые мазки со слизистых оболочек, любые современные исследования слизи, мокроты, кала в обязательном порядке заканчиваются тем, что будет найдено определенное количество самых разнообразных микробов. Обнаруженные микробы по-разному взаимодействуют с человеческим организмом. Это позволяет выделить три группы бактерий:

1.

Бактерии нормальные, мирные, безвредные или даже полезные, являющиеся естественными обитателями исследуемой среды;

2.

Бактерии опасные, с большой долей вероятности способные вызвать болезнь — патогенные. Их обнаружение — тревожный сигнал, повод к углубленному обследованию, лечению;

3.

Бактерии условно-патогенные — бактерии, мирно сосуществующие с организмом человека, но потенциально опасные, способные вызвать болезнь при определенных обстоятельствах, которые в большинстве случаев возникают тогда, когда ослабевает иммунная защита организма ребенка.

Алгоритм бактериологического исследования

Узнать имя микроба — это далеко не все, хотя и очень важно. Ведь обнаружить некую бактерию — например, в мазке из носа золотистый стафилококк — вовсе не значит доказать, что именно он является причиной насморка: вполне возможно, что стафилококк живет себе мирно в носоглотке, а насморк вирусный или аллергический

Как же разобраться?

Во-первых, понимать, что любые бактериологические исследования — это дополнительная диагностика, а основная диагностика — это реальные жалобы и симптомы.

Во-вторых, следует знать, что современные культуральные методы бактериологической диагностики позволяют не только обнаружить микроб, но и определить, какое количество бактерий присутствует во взятом для исследования материале. В результате мы получим из лаборатории бланк бактериологического исследования, в котором увидим не только имя бактерии, но и ее концентрацию. Выглядит это примерно так: «Обнаружен S. aureus 106», что означает: обнаружен золотистый стафилококк в концентрации 106 микробных клеток на миллилитр (м.к./мл).

Выявив рост бактерий, можно ответить на вопрос, к каким антибактериальным средствам (антибиотикам) они (бактерии) чувствительны. Для этого в питательную среду добавляют различные современные препараты и оценивают, прекращается ли размножение микробов. Прекращается — значит, бактерия чувствительна к данному антибиотику, не прекращается — устойчива.

Последовательность действий и особенности методики

Для проведения бактериологического исследования необходимо выполнить сбор материала и культивировать его на питательных средах с последующей микроскопией полученных штаммов и проверкой чувствительности к антибиотикам.

Сбор материала

Биоматериалом для исследования могут служить кровь, моча, ликвор, мокрота, сперма, кал, мазки из глотки, влагалища, уретры, любые другие ткани и жидкости из области инфекционного процесса. Образцы собирают в асептических условиях, помещают в стерильную посуду и в течение 2-х часов доставляют в лабораторию. При необходимости пробы хранят при пониженных температурах.

Культивирование

Культивирование проводят с применением механических или биологических методов. Механический подход с использованием стандартных искусственных сред – наиболее распространенный. В данном случае для высевания образцов используют жидкие и твердые питательные составы. Наиболее распространенные – агар, мясо-пептонный бульон.

Посев материала производят с помощью специальной петли или пастеровской пипетки, растирая полученный образец по поверхности или вводя его в толщу питательной среды. Выделение бактерий производят из чистых культур, которые получают повторным посевом ранее выращенных колоний на новую среду.

Биологические методы подразумевают использование специальных питательных сред, которые учитывают особенности микроорганизма, в частности, чувствительность к некоторым химическим веществам, в том числе антибиотикам. В некоторых случаях применяют метод заражения лабораторных животных или тканевых культур с отслеживанием патологических изменений. Такой подход актуален при крайне незначительном накоплении микроба в тканях человека – в этом случае его выделение посевом на питательных средах не дает результата.

Микроскопическое исследование

Основной метод бактериологической диагностики – бактериоскопия. Она подразумевает визуальную оценку параметров микроорганизма под микроскопом. Для этого используют фиксированные и нефиксированные препараты.

Нефиксированные препараты позволяют исследовать живые образцы бактерий. Основные методы:

• раздавленная капля – образец придавливают между предметным и покровным стеклами;
• висячая капля – образец помещают в лунку на предметном стекле и герметично накрывают покровным.В качестве среды используют изотонический раствор или расплавленный агар. Методика позволяет наблюдать за живыми микроорганизмами в течение нескольких дней.

Фиксированные препараты используют для окрашивания с подробным изучением морфологических и некоторых биохимических параметров патогенов. Каплю бактериального состава размазывают по предметному стеклу и фиксируют пламенем горелки или специальными химическими составами.

Для определения свойств бактериальных препаратов используют ряд общих и специфических методик:

• микроскопия – определение формы, размеров, окрашивания по Граму;
• биохимические методы – исследование ферментативной способности микроорганизма к расщеплению тех или иных углеводов, аминокислот, метаболитов, в том числе способность к гемолизу, фибринолизу при попадании в кровь живых существ;
• серологические методы идентификации – реакции агглютинации под воздействием специфической сыворотки и другие антигенные свойства;
• биологические методы – заражение лабораторных ждивотных с проверкой патогенности и токсигенности взятых образцов, их устойчивости к антибиотикам.

Только совокупный анализ результатов всех методов диагностики – микроскопических, биохимических, серологических, биологических – дает объективный результат для вынесения точного диагноза.

Теоретическая справка

Получение изолированных колоний

1. Метод Дригальского. Он заключается в том, что на бактериальную петлю наносится мазок с различными видами микроорганизмов. Этой петлей проводят по первой чашке Петри с питательной средой. Далее, не меняя петлю, методом остаточного материала проводят по второй и третьей чашкам Петри. Так, на последних образцах колонии бактерии будут засеваться не слишком плотно, тем самым упрощается возможность найти необходимые для работы бактерии.

2. Метод Коха. В нем используются пробирки с расплавленной питательной средой. Туда помещается петля или пипетка с мазком бактерий, после чего содержимое пробирки выливается на специальную пластинку. Агар (или желатин) застывает через какое-то время, а в его толще легко обнаружить нужные колонии клеток

Важно перед началом работы развести смесь бактерий в пробирках, чтобы концентрация микроорганизмов не была очень большой

Бактериологический метод исследования, этапы которого основаны на выделении нужной культуры бактерий, не обходится без этих двух способов нахождения изолированных колоний.